医疗网讯 动物的行为受脑中分子、细胞和环路活动的调节，但由于缺乏合适的方法，研究特定细胞中的特定蛋白如何调节行为却是一个巨大的挑战，对此问题的理解在神经疾病的研究及相应疗法的开发中非常关键。现在，我们迎来了针对上述问题的重大技术进展。昨日，Science重点报道了Michael R． Tadross博士的工作，他们研发了一种被称作DART的技术，并成功地对特定细胞的AMPA受体进行了药物干预，研究了帕金森病相关运动缺陷的分子机制，为解析行为的分子机制提供了全新研究手段。
DART技术介绍：
目前应用于动物行为研究的工具包括传统的药理学、基因改造的工具（如光遗传、化学遗传工具）和基因编辑技术，但这些技术各有其优缺点。传统药理学拥有靶向蛋白准确和作用迅速的优点，但细胞特异性差（图1A第一行）；基因改造的工具虽然细胞特异性强、作用迅速，但其靶向的细胞，无法特异操作细胞上的特定蛋白（图1A第二行）；基因编辑技术同时具有细胞特异性和蛋白特异性，但耗时长（图1A第三行）。
为了研究特定细胞的特定蛋白在行为和疾病中的作用，我们需要同时具有细胞、蛋白特异性，又作用迅速的工具，而DART技术具有上述所有优点（图1C）。
图1 DART技术的原理及与其他技术的比较
DART技术全称为Drugs acutely restricted by tethering，其原理如图1B。DART系统中，作者在一种改造的细菌酶HaloTag上连接了TM跨膜区域，这样HaloTag就可以独立表达并锚定在细胞膜上，同时不影响细胞本身蛋白的表达。此后，作者通过改造HaloTag的配体HTL（末端连接药物Rx），达到了HTL与HaloTag结合、将药物靶向性作用于特定受体的效果（图1B）。换句话说，作者在神经元上转入了一个锚定位点，该位点指引着药物来到该处行使作用，类似药物的“导航系统”。
DART技术的验证（培养神经元）
作者首先在培养的神经元上验证DART系统，他们选择AMPA受体作为研究对象。如图2，作者在突触前神经元转入光敏感通道ChR2，在突触后神经元转入GCaMP6s，同时在部分突触后神经元转入了HaloTagTM－2A－dTomato（图2D黄色，HT＋）或对照（图2D绿色，HT－），随后通过检测光刺激在突触后神经元引起的反应，检验DART系统的效用。
图2 DART技术特异性控制特定细胞AMPA受体的活动,
结果发现系统加入AMPA受体阻断剂YM90K结合的Rx－HTL（YM90K－DART）后，HT＋细胞AMPA受体活动被完全抑制，而HT－细胞不受影响（图2E－F）；同时，HT＋细胞的NMDA受体活动不受影响（图2G－H，下方视频）。这些结果充分说明了DART系统的细胞受体特异性。
DART技术的验证（纹状体脑切片）
接下来，作者在纹状体脑片验证DART技术的有效性。他们在已知的皮层－纹状体通路注射ChR2，利用Cre系统在纹状体SPN神经元表达HaloTagTM（HT＋）或对照（HT－），随后通过YM90K－DART的药物成功验证了DART技术。
图3 DART技术在纹状体脑片的功能验证
DART技术的验证（动物行为）
过去研究表明，改变单侧纹状体神经元活动会导致动物转身方向发生偏好。因而作者接下来在纹状体D1和D2神经元分别转入HaloTagTM（AAV2／1－DIO－HaloTagTM－2A－dTomato）（图4A），利用YM90K－DART检验DART系统。结果发现，对D1神经元的操作使动物总是左转，而对D2神经元的操作则使动物总是右转（图4B，下方视频），这说明DART技术能够区分同一脑区不同细胞所涉及的行为。
图4 DART技术在动物行为中的应用,
DART技术研究AMPA受体与帕金森相关运动缺陷
最后，作者利用DART技术研究了特定细胞AMPA受体与帕金森病相关的运动缺陷的关系。他们在左侧纹状体D1或者D2神经元表达HaloTagTM，并在左侧MFB脑区注射6－OHDA阻断左侧脑区多巴胺投射，构建帕金森模型，可以明显看到6－OHDA阻断后的小鼠的运动转向总是向左（图5D－F，黑色，视频3）。而一旦在D2细胞表达HaloTagTM的小鼠上给予YM90K－DART，则能逆转这种转向偏好，D1细胞组无变化（图5D－F，下方视频）。这些结果说明纹状体D2细胞的AMPA受体与帕金森病相关的运动缺陷密切相关。
图5 利用DART技术研究帕金森相关运动缺陷的受体机制
总结：
Michael R． Tadross博士的工作开发了一种全新的DART技术，利用该技术结合特异启动子、病毒载体等工具，我们可以定向的研究特定脑区、特定细胞上的特定蛋白在行为和疾病中的作用，为疾病的机制研究和治疗发展奠定了里程碑式的基础。